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万博体育app下载链接万博体育matext官网优良品系选育研究(Ⅱ)
发布者:admin 发布时间:2009/4/17 16:25:56 阅读:

万博体育app下载链接万博体育matext官网优良品系选育研究(

——万博体育matext官网属五种不同来源植物遗传基础的AFLP分析

 周成明[1],庾晓红1高文远2

1.北京时珍万博体育manbetx手机登陆技术有限公司, 北京 102609; 2.天津大学药物科学与技术学院,天津 300072

   : 目的 研究万博体育matext官网属五种不同来源的植物的遗传基础,探讨AFLP分子标记技术在万博体育app下载链接万博体育matext官网优良栽培品系选育中的应用以及万博体育matext官网属五种不同来源的植物的亲缘关系。 方法 采用扩增片段长度多态性(AFLP)标记技术对万博体育app下载链接万博体育matext官网栽培新品系“阿勒泰1号”、“乌什1号”和常规栽培品系内蒙古万博体育app下载链接万博体育matext官网以及胀果万博体育matext官网、光果万博体育matext官网进行基因组DNA多态性、指纹图谱和UPGMA聚类分析 结果 64对引物组合中筛选出了15对引物组合进行多态性分析,以多态位点百分率最高的E-AGG/M-CAA组合构建万博体育matext官网属五种植物不同来源的指纹图谱。UPGMA聚类分析将五种不同来源的植物分为两组,表现出不同的亲缘关系。结论 “阿勒泰1号”、“乌什1号”形成了独特的基因构成,可以作为万博体育app下载链接万博体育matext官网优良栽培新品系选育目标进行深入研究;内蒙古产万博体育app下载链接万博体育matext官网与光果万博体育matext官网的亲缘关系最近。

关键词:万博体育app下载链接万博体育matext官网,光果万博体育matext官网,胀果万博体育matext官网;良种选育;AFLP;指纹图谱

Study on Selective Breeding of Glycyrrhiza uralensis ()

——AFLP analysis for genus Glycyrrhiza

ZHOU Cheng-ming1, Yu Xiao-hong1, GAO Wen-yuan3

(1. Beijing Shizhen herbal medicine technology Ltd., Beijing 102609, China; 2. The College ofPharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Abstract: Object Studies on genetic background of Glycyrrhiza and the application of amplified fragment length polymorphism (AFLP) to the select of breeding of Glycyrrhiza uralensis and relative relationships of different species in genus Glycyrrhiza. Methods The DNA polymorphism, fingerprinting, and UPGMA analysis of different species in genus Glycyrrhiza from Aletai, Wushi and Inner Mongolia were detected by AFLP technique. Results 15 primer combinations were screened from 64 primer combinations to analysis DNA polymorphism and the DNA fingerprinting were generated by primer combination E-AGG/M-CAA. UPGMA analysis showed that all the studied populations were clustered into two groups and have different relative. Conclusion The results showed that “Aletai No.1”, “Wushi No.1” have inimitable gene structure and should be studied more as new breed resource. On the other hand, Glycyrrhiza uralensis produced in Inner Mongolia is relative of Glycyrrhiza glabra.

Key words: Glycyrrhiza uralensis; Glycyrrhiza inflata; Glycyrrhiza glabra; selective breeding; AFLP; DNA fingerprinting

上篇论文主要研究了万博体育app下载链接万博体育matext官网栽培优良品系“民勤1号”的遗传基础及品系内的亲缘关系[1]。本论文主要研究万博体育app下载链接万博体育matext官网栽培新品系“阿勒泰1号”的遗传基础及与万博体育matext官网属内植物的亲缘关系。由于数十年来人工大量的采挖野生万博体育app下载链接万博体育matext官网,导致内蒙古主产区万博体育app下载链接万博体育matext官网种源急剧减少,种籽质量降低,无法满足大面积栽培需要。我们从2002年开始采集内蒙古以外地区的万博体育app下载链接万博体育matext官网种源进行大面积栽培并选育优良栽培新品系,从中发现“阿勒泰1号”,根系发达,主根直、长,根皮淡红色,地上植株矮小紧凑,适合密植。在甘肃酒泉栽培3年每公顷产量约30000公斤鲜根,比内蒙古万博体育app下载链接万博体育matext官网产量每公顷产量约高4500公斤,万博体育matext官网酸含量超过2%。目前,我公司已推广约4000公顷“阿勒泰1号”。“乌什1号”叶小,茎杆直立,抗到伏,正在选育过程中。

为了确认万博体育app下载链接万博体育matext官网栽培新品系“阿勒泰1号”、“乌什1号”与常规内蒙古产万博体育app下载链接万博体育matext官网在遗传本质上是否有所不同,以及不同栽培品系的万博体育app下载链接万博体育matext官网与光果万博体育matext官网及胀果万博体育matext官网的亲缘关系,本文应用AFLP技术[23]对万博体育matext官网属以上五种不同来源的植物进行遗传基础分析。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用材料为常规内蒙古产万博体育app下载链接万博体育matext官网、万博体育app下载链接万博体育matext官网栽培新品系阿勒泰1乌什1、光果万博体育matext官网和胀果万博体育matext官网种子。种子由北京时珍万博体育manbetx手机登陆技术有限公司周成明采集鉴定。取干种子常规发芽,每种材料分别取10株胚根,混为一份样品,提取DNA组织。

1.2 DNA组织提取

    采用CTAB法提取[4] 

1.3 AFLP分析

模板DNA的酶切、连接、预扩增和选择性扩增的反应液配方和反应程序由北京鼎国生物公司设计进行。

1.4 AFLP图谱分析

应用ABI 377测序仪进行AFLP多态性分析。

1.5 数据处理

    将电泳图谱上清晰可见且可重复出现的条带记为“1,同一位置没有出现的条带记为“0,生成由“1和“0组成的原始矩阵。计算多态性位点百分率(p): p=(k/n)×100%,其中k是多态位点数目;n为所测位点总数。用AFLP-SURVEY 1.0 (Vekemans et al.,2002)软件计算每个居群的多态位点数, 多态位点百分率(P),并计算居群、物种水平的遗传多样性(He)(Nei, 1978)[5]Jaccard 相似系数为参数用NTSYSpc 2.0 (Rohlf ,1994)[6]40个万博体育app下载链接万博体育matext官网样品用非加权配对算术平均的方法(Unweighted pair-group method with arithmetic mean , UPGMA) 进行聚类分析。

2   

2.1 AFLP分析的引物筛选及其标记的多态性

由此对Eco RI标记引物E-AACE-AAGE-ACAE-ACTE-ACCE-ACGE-AGCE-AGG(8)Mse I 标记引物M-AAM-ACM-AGM-ATM-TAM-TCM-TGM-TT(8)完全排列组成的64对引物组合进行筛选,从中选出了15谱带清晰、带型分布均匀并且多态性高的引物组合,共扩增出2001条带谱,平均每个引物扩增出133条。15, 对引物共扩增出多态性带1030条,多态位点百分率为51.47% (1)

 1 适宜于万博体育matext官网属AFLP分析的15个引物组合序列及其扩增结果

Table 1 The base sequence of 15 primer combinations for AFLP analysis; and AFLPs generated among 50 individuals using the 15 combinations

引物组合

Primer combination

引物序列

Prime sequence(5-3)

总位点数

Total bands

多态位点数

Polymorphic bands

多态位点百分率P

Polymorphism( %)

E-AAC/M-CAA

GACTGCGTACCAATTCAAAC

GATGAGTCCTGAGTAACAA

134

72

53.7

E-AAC/M-CAC

GACTGCGTACCAATTCAAAC

GATGAGTCCTGAGTAACAC

169

86

50.9

E-AAC/M-CAG

GACTGCGTACCAATTCAAAC

GATGAGTCCTGAGTAACAG

119

62

52.1

E-AAC/M-CAT

GACTGCGTACCAATTCAAAC

GATGAGTCC TGAGTAACAT

126

66

52.4

E-AAC/M-CTC

GACTGCGTACCAATTCAAAC GATGAGTCCTGAGTAACTC

118

58

49.2

E-AAC/M-CTG

GACTGCGTACCAATTCAAAC GATGAGTCCTGAGTAACTG

136

71

52.2

E-AAC/M-CTT

GACTGCGTACCAATTCAAAC GATGAGTCCTGAGTAACTT

128

69

53.9

E-AAG/M-CAA

GACTGCGTACCAATTCAAAG GATGAGTCCTGAGTAACAA

146

61

41.8

E-AAG/M- CAC

GACTGCGTACCAATTCAAAG GATGAGTCCTGAGTAACAC

150

80

53.3

E-AAG/M- CAG

GACTGCGTACCAATTCAAAG GATGAGTCCTGAGTAACAG

124

63

50.8

E-AAG/M-CTC

GACTGCGTACCAATTCAAAG GATGAGTCCTGAGTAACTC

111

60

54.1

E-AGG/M-CAA

GACTGCGTACCAATTCAAGG GATGAGTCCTGAGTAACAA

140

77

55

E-AGG/M-CAG

GACTGCGTACCAATTCAAGG GATGAGTCCTGAGTAACAG

138

64

46.4

E-AGG/M-CTG

GACTGCGTACCAATTCAAGG GATGAGTCCTGAGTAACTG

120

65

54.2

E-AGG/M-CTT

GACTGCGTACCAATTCAAGG GATGAGTCCTGAGTAACTT

142

76

53.5

总计/平均

 

2001/134

1030/67.5

--/51.47

 2.2 万博体育matext官网属植物遗传多样性分析

   万博体育matext官网属五种不同来源的植物的多态位点数在65~74之间,多态位点百分率从46.8%(胀果万博体育matext官网)到56.6%(光果万博体育matext官网)不等(表2);而万博体育app下载链接万博体育matext官网不同栽培品系的多态位点数以内蒙古对照最高,“阿勒泰1号”次之,“乌什1号”最低,多态位点百分比率分别为55.2%53.4%48.3%

万博体育matext官网属五种不同来源的植物的遗传多样性在0.16730.1986之间,其中光果万博体育matext官网的遗传多样性最大(0.1986),遗传多样性最小的是胀果万博体育matext官网(0.1673),属内的平均遗传多样性Hep=0.1864。对于万博体育app下载链接万博体育matext官网各栽培品系的遗传多样性以内蒙古对照(0.1982)最高,“阿勒泰1号”(0.1893)次之,“乌什1号”(0.1784)最低(表2)。

2 万博体育matext官网属五种不同来源植物的遗传多样性分析

Table 2 Genetic diversity within different species of Glycyrrhiza

品种

Population

样品数

Number of sample

多态位点数

Polymorphic sites

多态位点百分率

PPB(%)

基因多样性(He)

Gene diversity

标准差

Standard error

内蒙古Neimongo

10

72

55.2

0.1982

0.01646

阿勒泰1

Aletai No.1

10

70

53.4

0.1893

0.01501

乌什1

Wushi No.1

10

68

48.3

0.1784

0.01432

胀果万博体育matext官网

Glycyrrhiza inflata

10

65

46.8

0.1673

0.01605

光果万博体育matext官网

Glycyrrhiza glabra

10

74

56.6

0.1986

0.01732

平均

Population

10

66.5

53.2

0.1864

-

注:PPB=Percentage of polymorphic sites

 2.2 指纹图谱构建

在筛选出的15对引物组合中,E-AGG/M-CAA组合共扩增出140条带谱,扩增的DNA片段在50bp~450bp之间,其中多态性带谱为77条,共有带43条,多态位点百分率达到了55%,为各引物中最高。特异性谱带12条,其中“阿勒泰1号”分别在82bp,90bp,116bp,295bp,330bp个位点处有区别于内蒙古万博体育app下载链接万博体育matext官网的特征谱带,“乌什1号”具有的特异性谱带数分别为2条(310bp,430bp),而光果万博体育matext官网与内蒙古万博体育app下载链接万博体育matext官网相比较在102bp,165bp, 291bp, 330bp,350bp五个位点处具有特征谱带,胀果万博体育matext官网则具有3条特征谱带(85bp, 98bp, 210bp)。因此,该引物组合具有较强的检测万博体育matext官网属不同来源植物的基因型间遗传变异差异性的能力,用以构建指纹图谱(1)
 

 
1:内蒙古对照, 2:阿勒泰1, 3:乌什1, 4:胀果万博体育matext官网, 5:光果万博体育matext官网

1: Inner Mongolia, 2:Aletai No.1, 3:Wushi No.1, 4:Glycyrrhiza inflata, 5:Glycyrrhiza glabra

1 基于E-AGG/M-CAA引物组合的万博体育matext官网属植物的AFLP指纹图谱

Fig.1 AFLP fingerprinting amplified with primer E-AGG/M-CAA

2.3 聚类分析

依据以上15对引物所扩增出的万博体育matext官网属的不同植物的2001DNA带谱的数据,按照Jaccard 相似性系数进行UPGMA聚类,构建供试材料间的亲缘关系树状图(图2)。

由图2可以看出,所研究的万博体育matext官网属的植物被聚为两组。其中,内蒙古对照与光果万博体育matext官网聚为一组;“乌什1号”、“阿勒泰1号”与胀果万博体育matext官网被聚为一组,在0.60处胀果万博体育matext官网被分离出。结果表明,内蒙古万博体育app下载链接万博体育matext官网和光果万博体育matext官网之间亲缘关系最近;万博体育app下载链接万博体育matext官网栽培新品系“阿勒泰1号”与“乌什1号”之间的亲缘关系也较近,而胀果万博体育matext官网与其余种的亲缘关系较远。

c1:内蒙古对照; c2:阿勒泰1号; c3:乌什1号; c4:胀果万博体育matext官网;c5:光果万博体育matext官网

c1: Inner Mongoliac2: Aletai No.1 c3:Wushi No.1 c4: Glycyrrhiza inflata c5:Glycyrrhiza glabra

2 基于AFLP 数据的万博体育matext官网属五种不同来源植物UPGMA 聚类图

Fig. 2 Dendrogram illustrating the genetic relationships among Glycyrrhiza accessions based on UPGMA cluster analysis of AFLP data

3   

新疆天山南北及塔克拉玛干沙漠周边地区是万博体育matext官网属植物的发源地,该地区气候条件恶劣,沙尘暴频繁,昼夜温差大,蕴藏着丰富的万博体育matext官网属植物资源。万博体育app下载链接万博体育matext官网、光果万博体育matext官网、胀果万博体育matext官网同时长期生长在该地区,它们之间一定存在着某种亲缘关系,并产生某种程度的变异,而这种变异正是我们进行万博体育matext官网新品系选育的基础。

“阿勒泰1号”、“乌什1号”分别采集于新疆的阿勒泰地区、乌什县的野生种群,经连续七年的大面积引种栽培,发现与常规人工栽培品系内蒙古产万博体育app下载链接万博体育matext官网相比,在单位面积产量、株型、抗性、产品品质等方面具有显著的优势,目前正大面积推广累积超过4000公顷

分析结果表明,光果万博体育matext官网与内蒙古产万博体育app下载链接万博体育matext官网亲缘关系最近,而胀果万博体育matext官网距离二者较远,由此看来,内蒙古产万博体育app下载链接万博体育matext官网与光果万博体育matext官网、胀果万博体育matext官网存在某种进化关系,万博体育app下载链接万博体育matext官网有可能经过数百万年的演化变异,进化到光果万博体育matext官网。该推论有待进一步研究。

 References

[1]  Zhou C M, Xu B, Zhang J T, Gao W Y. Study on Selective Breeding of Glycyrrhiza uralensis (Ⅰ)[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs(万博体育manbetx手机登陆).2007, 38(7):1078~1081

[2]  Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research, 1995,23(21):4407-4414

[3]  Sun Q L, Liang Y R, Ding Z T, et al. AFLP molecular marker technique and its application to tea Genetic and breeding research[J]. Journal of Tea(茶叶),2004,30(4):203-206

[4]  Doyle J J, Doyle J L. Isolation of plant DNA from fresh tissue [J] . Focus, 1990, 12 (1): 13 -15

[5]  Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J]. Genetics , 1978, 89 , 583- 590 .

[6]  Rohlf FJ. NTSYS- pc, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2. 0. Exeter Software[M] , Setauket , New York. 1994



[1]收稿日期:

基金项目: 国家自然科学基金“卫星搭载万博体育matext官网种质选育的研究”,编号30472148

通讯作者: 庾晓红,博士,daning5339@sohu.com010-6125988615901208830



 
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